Bilgi Merkezi · Analiz · Spektrofotometri
Spektrofotometri Temelleri: Absorbans ve Beer-Lambert
Spektrofotometre, bir numunenin belirli dalga boyunda ne kadar ışık soğurduğunu ölçer. Soğurulan miktar (absorbans), Beer-Lambert yasasına göre derişimle doğru orantılıdır; bu yüzden bilinen standartlarla kalibrasyon eğrisi kurularak bilinmeyen derişim bulunur. Doğru sonuç; doğru dalga boyu, temiz küvet ve düzgün kalibrasyona bağlıdır.
Spektrofotometre ne ölçer?
Renkli veya ışık soğuran bir çözelti, gelen ışığın bir kısmını yutar. Spektrofotometre bunu sayısallaştırır: seçilen bir dalga boyunda numuneden geçen ışığı, referansla (kör/blank) karşılaştırıp ne kadarının soğurulduğunu ölçer. Bu değere absorbans (A) denir. Çoğu renk-ölçüm, enzim/kit testi ve derişim tayini bu ilkeye dayanır.
Beer-Lambert: absorbans neden derişimi verir?
Temel bağıntı Beer-Lambert yasasıdır: A = ε · b · c. Burada ε maddeye ve dalga boyuna özgü soğurma katsayısı, b ışığın çözeltide kat ettiği yol (küvet kalınlığı), c ise derişimdir. Sabit küvet ve dalga boyunda absorbans derişimle doğru orantılıdır; bu yüzden bilinen derişimli standartlarla bir kalibrasyon eğrisi çizilir ve bilinmeyen numunenin absorbansı bu eğriden derişime çevrilir.
Ne zaman dikkat?
| Etken | Etkisi | Doğru uygulama |
|---|---|---|
| Yanlış dalga boyu | Düşük duyarlık | Maddenin en yüksek soğurma dalga boyunu seç |
| Yüksek derişim | Doğrusallık bozulur | Seyrelt; eğrinin doğrusal aralığında kal |
| Kirli/çizik küvet | Sahte absorbans | Küveti temizle, aynı yönde yerleştir |
| Kör (blank) atlanması | Kayık okuma | Her seride çözücü körüyle sıfırla |
Doğru bilgi, doğru cihaz: spektrofotometri güçlü ama koşullu bir yöntemdir; sonuç ancak doğru dalga boyu, doğrusal aralık, temiz küvet ve düzenli kalibrasyonla güvenilirdir.
Nasıl ölçülür?
Bir spektrofotometrik ölçümün doğru adımları:
- Maddenin soğurma yaptığı doğru dalga boyunu seçin (genelde en yüksek soğurma noktası).
- Çözücü/kör (blank) ile cihazı sıfırlayın (otomatik referans).
- Bilinen derişimli standartlarla kalibrasyon eğrisi kurun; doğrusal aralığı belirleyin.
- Numuneyi bu aralığa girecek şekilde seyreltin; küveti temiz ve aynı yönde yerleştirin.
- Absorbansı okuyup eğriden derişime çevirin; şüpheli yüksek okumada seyreltip tekrarlayın.
İpuçları:
- Absorbans çok yüksekse (doğrusal-dışı) sonuç güvenilmez — seyreltin.
- Küvet parmak izi/çizik ve hava kabarcığı sahte absorbans üretir.
Kaynaklar
- Beer-Lambert yasası ve absorbans-derişim ilişkisi — genel spektroskopi ilkeleri
- Kalibrasyon eğrisi ve doğrusal çalışma aralığı
- Küvet, kör (blank) ve dalga boyu seçimi iyi uygulamaları